? ?廣州龍躍自動(dòng)化專業(yè)破解解密各類plc加密，全國24小時(shí)聯(lián)系手機(jī)：18520649527 【關(guān)技術(shù)】 微信：guanshiyou009如有任何問題請(qǐng)打手機(jī)或者添加微信，謝謝支持

桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)服務(wù)案例—鐘鼎生物

一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)?

按照客戶的預(yù)期，期望通過桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)以胞外分泌的形式獲得目的蛋白，因此我們分析客戶提供的Target-Gene序列，整個(gè)蛋白序列呈親水性，自身不帶信號(hào)肽序列，并且序列本身含有昆蟲細(xì)胞的稀有密碼子，因此我們?cè)O(shè)計(jì)思路為：

1.1、以客戶的基因序列翻譯的蛋白序列為源模板，通過密碼子優(yōu)化一套最適宜SF9細(xì)胞系的基因序列。

1.2、在蛋白序列N端添加GP67信號(hào)序列幫助蛋白穿膜分泌表達(dá)至胞外，在C端添加6XHis-Tag便于重組蛋白的檢測(cè)和親和純化。

依據(jù)上述設(shè)計(jì)思路，以基因合成的方式構(gòu)建pFast-bac1-target-gene表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后通過藍(lán)白篩選方法獲得重組的Bacmid，經(jīng)PCR鑒定之后轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞，以獲得P1代病毒和P2代病毒。侵染200ml小試表達(dá)，通過western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)情況，確認(rèn)蛋白表達(dá)情況，再通過Ni-resin親和純化獲得80%以上目的蛋白。

二、試劑和耗材

轉(zhuǎn)染試劑（購自invitrogen公司）；培養(yǎng)基（購自HYclone公司）；抽提試劑盒（購自Axygen公司）；PCR試劑盒（IO-RAD公司)；血清（購自invitrogen公司）；六孔板（購自corning公司）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（購自corning公司）；離心管（購自corning公司）；PCR反應(yīng)管(購自Fisher公司)；Agarose(購自上?；蚬?；DNA膠純化試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒(購自AXYGEN公司)；低熔點(diǎn)瓊脂糖（購自sigma公司）；中性紅（購自碧云天生物公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

三、主要實(shí)驗(yàn)儀器

Allegra 21R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) (美國BECKMAN公司)，臺(tái)式高速離心機(jī)(德國SORVAL公司)，Biologic LP層析系統(tǒng)、Mini Protean II垂直平板電泳系統(tǒng)、Gel Doc2000成像系統(tǒng)、水平電泳系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)，PTC-200基因擴(kuò)增儀(美國MJ Research公司)

320-S pH計(jì)(美國Mettler Toledo公司)，AR5120電子天平(美國AHOM S公司)，MultiTemp III 恒溫水浴鍋、Hofer ΜV-25紫外透射儀(美國Amersham Pharmacia公司)，雪花狀制冰機(jī)(日本SANYO公司)，JY92-2D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(中國新芝科器研究所)，蛋白核酸檢測(cè)儀（南京大學(xué)普陽科學(xué)儀器廠），超凈工作臺(tái)(中國蘇凈集團(tuán))，NANODROP2000（美國Thermo公司）

四、蛋白性質(zhì)分析

4.1 客戶提供原始基因序列

GTGGGGTGCT******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客戶研究內(nèi)容，不予顯示----NNNNNNNNNNNNNNN*******CTTCTCCCTT

4.2 編碼的蛋白序列如下（理論分子量41.18KD，理論等電點(diǎn)PI6.73）

GCSVDFSK******NNNNNNNNNNNNNN---------涉及客戶研究內(nèi)容，不予顯示----NNNNNNNNNNNNNNN*******TAGSTDHMDHFSL

4.3 稀有密碼子序列分析如下圖所示（紅色：使用頻率低于10% 灰色：使用頻率低于20%，綠色為正常頻率密碼子）

4.4 蛋白序列跨膜及親疏水性分析

4.5 信號(hào)肽預(yù)測(cè)

綜上所述：

1、蛋白理論分子量為 41KD，屬于正常分子量范圍，較適宜表達(dá)。

2、通過對(duì)基因密碼子使用頻率的分析，如果以293細(xì)胞為表達(dá)宿主，基因序列上使用頻率低于20%的密碼子X個(gè)，使用頻率低于10%的密碼子X個(gè)，優(yōu)化后通過基因合成方式獲得目的基因。

3、通過對(duì)蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)和親疏水性分析，蛋白整體呈親水性，但從473AA之后，蛋白存在典型的跨膜結(jié)構(gòu)，建議去除后表達(dá)以提高成功率。

4、目的蛋白自身無信號(hào)肽，添加GP67信號(hào)肽便于蛋白分泌表達(dá)。為了純化方便，考慮在C端添加His標(biāo)簽。

五、實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

5.1 pFast-bac1-target-gene表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成target-gene基因，雙酶切連接至pFast-bac1載體的BamH I和Hind III之間；將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入TOP10克隆菌株，挑取陽性克隆子測(cè)序，測(cè)序結(jié)果拼接如下所示，單劃線區(qū)為目的基因基因區(qū)域。紫色區(qū)域?yàn)槊盖形稽c(diǎn)，黃色區(qū)域?yàn)镚P67信號(hào)肽，綠色區(qū)域?yàn)?XHis標(biāo)簽；

g c c a c c A T G T T A C T C G T C A A C C A G A G C C A C C A A G G G T T T A A C A A G G A A C A C A C A T C C A A A A T G G T T T C A G C T A T C G T G CT T T A T G T T C T T C T T G C C G C G G C A G C T C A T T C T G C A T T C G C G A G A T T G G C T T G T A A G G A A G A T T A C A G A T A T G C C * * * * * * N N N N N N N ---略--- N N N N N N N * * * * * A T C A T C A C C A T C A C C A T C A C T A A a a g c t t

5.2 使用Chromas軟件查看測(cè)序峰圖文件，截取部分序列示例如下：

5.3 pFast-bac1-XXX質(zhì)粒酶切圖與載體構(gòu)建示意圖如下所示：

5.4 重組桿狀病毒表達(dá)載體（Bacmid，桿粒）的構(gòu)建

5.4.1 桿粒菌株轉(zhuǎn)化

DH10Bac E.coli 感受態(tài)細(xì)胞冰上解凍；(2)將200ng的pFastBac1-gene轉(zhuǎn)移載體緩慢加入感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；(3)冰上放置30min，然后42℃熱擊90s；(4)迅速冰上靜止5min； (5)向EP管里加入900 μl S.O.C.培養(yǎng)基；(6)37℃，225 rpm震蕩搖菌4h；(7)取100μl菌液涂于含有50 mg/ml 卡那霉素，7 mg/ml 慶大霉素，10 mg/ml 四環(huán)素，100 mg/ml x-gal,and 40 mg/ml IPTG的LB平板；(8)37℃，倒置培養(yǎng)48h。

5.4.2 重組Bacmid質(zhì)粒的鑒定

挑取3個(gè)白色單克隆菌落接種分別接種于5ml含有50 mg/ml卡那霉素，7 mg/ml 慶大霉素，10 mg/ml 四環(huán)素，搖菌，菌液PCR初步篩選陽性克隆菌。小量抽取質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證桿粒正確性，因桿粒大小135Kb，酶切方式很難進(jìn)行驗(yàn)證，故采用PCR進(jìn)行驗(yàn)證，理論上，若目的基因成功轉(zhuǎn)座至Bacmid中，那擴(kuò)增產(chǎn)物的大小應(yīng)為（2300bp+目的基因長度）

5.5轉(zhuǎn)染及收獲病毒

5.5.1 sf9細(xì)胞的培養(yǎng)

sf9細(xì)胞培養(yǎng)使用SF 900Ⅱ培養(yǎng)基培養(yǎng)，一般每3天分瓶傳代一次。處于對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞且細(xì)胞活力大于95%的sf9 細(xì)胞用于轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

5.5.2 Sf9細(xì)胞凍存方法：

細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，活力超過90%; 計(jì)數(shù)，使得儲(chǔ)存濃度為1×107 /ml至2×107 /ml; 準(zhǔn)備所需量的儲(chǔ)存培養(yǎng)液，加DMSO至10%和FBS至30%，預(yù)冷培養(yǎng)液保存于4℃; 離心懸浮細(xì)胞或單層細(xì)胞 100×g，5min，用預(yù)冷的凍存液懸浮至所需密度; 混勻，分裝至凍存管; 將凍存管放入填有脫脂棉的泡沫盒，-80℃放置1天；移入液氮罐中保存。

5.5.3 Bacmid轉(zhuǎn)染sf9細(xì)胞

(1)在六孔板中接種9×105個(gè)細(xì)胞/2ml/孔。其中培養(yǎng)基Grace’s medium中含有青霉素50U/ml，鏈霉素50ug/ml，10％FBS；

(2) 27℃培養(yǎng)1h，使細(xì)胞貼壁;?

(3) 在這期間制備Bacmid與Cellfectin Reagent復(fù)合物：

A. 用100ul不完全Grace’s medium（不含雙抗、FBS）稀釋1ug Bacmid（約5ul）;?

B. 在使用前將Cellfectin Reagent倒置5~10次，使其充分混勻，取6ul Cellfectin Reagent用100ul不完全Grace’s medium（不含雙抗、FBS）稀釋;?

C. 將上述兩種稀釋液合并（總體積約210ul），輕輕混勻，室溫孵育15~45min;?

(4) 在制備Bacmid與Cellfectin Reagent復(fù)合物期間，將六孔板中的培養(yǎng)基吸掉，用2ml不完全Grace’s medium（不含雙抗、FBS）洗滌一次，去掉培養(yǎng)基;?

(5) 在含有210ul的復(fù)合物的管內(nèi)加入800ul的不完全Graces medium（不含雙抗、FBS），輕輕混勻，加到每個(gè)孔中;?

(6) 將六孔板內(nèi)的細(xì)胞孵育5h，27℃；

(7) 去掉復(fù)合物混合液，然后在每個(gè)孔中加2ml完全培養(yǎng)基（SF900含雙抗、10％FBS）；

(8) 在27℃濕度培養(yǎng)箱中孵育72h或著直到細(xì)胞出現(xiàn)病毒感染跡象。上清和沉淀需要分別制備樣品，待后期western blot表達(dá)鑒定使用。

5.5.4 P1病毒液的收集

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)感染跡象時(shí)，將細(xì)胞上清轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，1000rpm離心5min以去除細(xì)胞及大的碎片，可用蛋白結(jié)合率低的0.2um的濾膜過濾，滴度損失小于10%；將含病毒的上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)無菌帶蓋的EP管中（一般，P1的滴度在10^6pfu/ml左右）, 將得到的病毒液體避光置于4℃冰箱（短期）。若長期保存，進(jìn)行1ml分裝，避光儲(chǔ)存于-80℃。

5.5.5 P2病毒擴(kuò)增及收獲

原代病毒滴度(P1)較低，介于1×106~1×107，擴(kuò)增后滴度為1×107~1×108。 50ml搖瓶中加入適量的P1病毒。擴(kuò)增病毒時(shí)可用下列公式進(jìn)行計(jì)算：

MOI(Multiplicity of infection)在0.01~0.1之間,?

接種量 （ml）:desired MOI (phf/ml) ×(total number of cells) tlter of viral inoculum (puf/ml)?

感染細(xì)胞48 h收集的病毒擴(kuò)增的將近100倍，超過48h 收集的病毒質(zhì)量較低。每種病毒的收集時(shí)間都有一定的差別，如在72h收集，但是隨著細(xì)胞的裂解，病毒的增殖活力會(huì)受損。

5.5.6 病毒滴度檢測(cè)

六孔板中細(xì)胞120萬/孔，靜置培養(yǎng)1h，病毒梯度稀釋101 102 103 104 105 106 107 108 ，去掉六孔板中的上清，取106、107、108三個(gè)滴度病毒加入到六孔板中，平行對(duì)照2組，孵育1h，配置空斑培養(yǎng)基，每孔加入2mL空斑培養(yǎng)基；第四天加入中性紅染色液；7-10天計(jì)數(shù)空斑數(shù)，算病毒滴度。

5.6 重組蛋白表達(dá)純化

f9細(xì)胞以2×106/ml瓶接種于500ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中；待細(xì)胞生長至對(duì)數(shù)期，接P2代病毒感染sf9細(xì)胞；48~72h內(nèi)收集細(xì)胞及上清，用于重組蛋白表達(dá)的檢測(cè)。

1、依此條件方法放大培養(yǎng)。4℃ 10000g離心20 min，取上清；

2. 利用低壓層析系統(tǒng)，上清液以0.5 ml/min流速上樣至Ni-IDA Binding-Buffer預(yù)平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B親和層析柱；

3. 用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280值到達(dá)基線；?

4. 用Ni-IDA Washing-Buffer(20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速?zèng)_洗，至流出液OD280值到達(dá)基線；

5. 用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脫目的蛋白，收集流出液；

6.將上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS（PH7.4）進(jìn)行透析過夜；

7. 進(jìn)行10% SDS-PAGE分析。

5.7 Western Blot檢測(cè)

1. 樣品上樣0.01ug。

2. 上樣完畢后，聚丙烯酰胺凝膠先90V跑完積層膠，再將電壓升至200V直到電泳結(jié)束。

3. 電泳結(jié)束后，取下凝膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒壓100V轉(zhuǎn)膜，約為1.5小時(shí)。

4. 電轉(zhuǎn)結(jié)束后，取下膜后先用PBS洗滌4次，每次5分鐘。然后置于5%脫脂奶粉封閉液中封閉37℃ 1小時(shí)。

5. 用封閉液稀釋一抗，膜在一抗稀釋液中37℃反應(yīng)1小時(shí)。

6. 洗膜4次，每次5 分鐘；用含5%牛奶的封閉液稀釋二抗。膜在二抗中37℃反應(yīng)1小時(shí)。

7. 洗膜ECL顯影。

六. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析

6.1 質(zhì)粒鑒定結(jié)果

6.1.1 質(zhì)粒濃度

6.1.2 PCR鑒定結(jié)果

說明：

目的基因2600bp，使用pUC/M13引物擴(kuò)增產(chǎn)物理論大小為4900bp，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期一致。

6.2 P2代病毒蛋白表達(dá)鑒定

6.3 病毒滴度檢測(cè)，采用病毒空斑實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)病毒滴度

說明：

P2代病毒感染sf9細(xì)胞，通過檢測(cè)細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液發(fā)現(xiàn)：目的蛋白大部分存在上清中，正常分泌至胞外。

說明：

通過6孔板病毒空斑實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)病毒低毒，可以確認(rèn)我們提供的病毒低毒達(dá)到107pfu/ml。

6.4 通過Ni-IDA-Resin親和純化目的蛋白，獲得純度約85%的目的蛋白

說明：

通過Ni-IDA-resin收集目的蛋白，經(jīng)過濃縮處理后使用SDS-PAGE檢測(cè)，得到了85%以上的目的蛋白。

說明：

通過SEC-HPLC進(jìn)一步純化，獲得單一峰的目的重組蛋白，HPLC檢測(cè)純度在95%以上。

七. 發(fā)貨清單

序號(hào)類型名稱規(guī)格常數(shù)

1克隆質(zhì)粒PMD18-target gene2-4ug2

2克隆菌株P(guān)MD18-target gene in DH5 α1ml1

3表達(dá)菌株P(guān)Fast-Bac1-target2-4ug2

4桿粒bacmidBacmid-target in TOP101ml1

5P2代病毒MT 107pfu/ml1ml5

6重組蛋白MT protein 純度85%，濃度 0.5mg/ml1ml3

鐘鼎生物官網(wǎng)

[img]

【線粒體-臨床 IF2.456】肌酸，輔酶Q10和硫辛酸對(duì)線粒體疾病的有益作用

Beneficial effects of creatine, CoQ10, and lipoic acid in mitochondrial disorders.

肌苷，輔酶Q10和硫辛酸對(duì)線粒體疾病的有益作用

【作 者】M Christine Rodriguez;Jay R MacDonald;Douglas J Mahoney;Gianni Parise;M Flint Beal;Mark A Tarnopolsky

【刊 名】Muscle nerve

【出版日期】2007

【卷 號(hào)】Vol.35

【頁 碼】235-242

【doi】10.1002/mus.20688

【影響因子】2.456（2007）? 2.283（2015）

摘要： 線粒體疾病具有共同的細(xì)胞后果：（1）ATP產(chǎn)生減少；（2）增加對(duì)替代厭氧能源的依賴；（3）增加活性氧的產(chǎn)生。本研究的目的是確定聯(lián)合治療的效果（肌酸一水合物，輔酶Q?10，以及針對(duì)上述細(xì)胞后果的硫辛酸，使用線粒體細(xì)胞病患者的隨機(jī)，雙盲，安慰劑對(duì)照，交叉研究設(shè)計(jì)，針對(duì)多個(gè)結(jié)果變量。 3例患有線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作（MELAS），4例存在線粒體DNA缺失（3例慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹患者和1例Kearns-Sayre綜合征患者），還有9例其他非線粒體疾病分為前兩組。 聯(lián)合療法可降低所有患者組的靜息血漿乳酸和尿8-異前列腺素，并減輕峰值踝背屈強(qiáng)度的下降，而僅MELAS組觀察到較高的無脂肪量。一起，這些結(jié)果表明，針對(duì)線粒體功能障礙的多個(gè)最終共同途徑的聯(lián)合療法可有利地影響細(xì)胞能量功能障礙的替代標(biāo)志物。將來需要在相對(duì)均一的人群中進(jìn)行更大樣本量的研究，以確定這種聯(lián)合療法是否影響功能和生活質(zhì)量。

線粒體疾病代表一組影響線粒體能量傳導(dǎo)的疾病，其特征是臨床，生化和遺傳異質(zhì)性。 18 盡管表型表達(dá)差異很大，但大多數(shù)患者合并有乳酸性酸中毒，中風(fēng)或癲癇發(fā)作，頭痛，色素性視網(wǎng)膜炎，上瞼下垂，運(yùn)動(dòng)耐力低下，眼肌麻痹，心肌病，神經(jīng)病和視力減退。 16 ， 29 ， 38

線粒體功能障礙導(dǎo)致許多細(xì)胞后果，包括：（1）ATP生成減少；（2）增加對(duì)替代厭氧能源的依賴；（3）增加活性氧（ROS）的產(chǎn)生。 16 ， 37 沒有療效的治療線粒體疾病，大多數(shù)策略的目的是為了緩解上述蜂窩后果。 16 ， 18 上的患者的線粒體疾病的治療策略的報(bào)告已經(jīng)檢查的單一化合物的效果，如輔酶Q?10（輔酶Q?10） 2 ， 4 ， 21 或肌酸（CRM）。 13 ， ?14 ， ?38 基于的概念，即線粒體功能障礙導(dǎo)致一些細(xì)胞的病理生理學(xué)后果， ?33個(gè) 為線粒體疾病大多數(shù)治療策略具有相對(duì)于單一療法使用的聯(lián)合治療（或治療“雞尾酒”）。某些研究已經(jīng)評(píng)估了針對(duì)上述三種方法中的一種以上的聯(lián)合療法的療效。然而，這些是任何一種情況下報(bào)告， ?8 ， ?25次 開放試驗(yàn)中， ?1 ， ?19 ， ?20 ， ?27 ， ?32 或回顧性研究。 26

基于線粒體疾病人體試驗(yàn)的潛在功效證據(jù)或人體試驗(yàn)或體外研究的證據(jù)顯示擬議的化合物可以緩解線粒體功能障礙的一種或多種最終常見途徑，我們建議評(píng)估聯(lián)合用藥的潛在療效下列化合物：（1）CrM（替代能源 36 和抗氧化劑 30 ）； （2）α-硫辛酸（抗氧化劑 17 和可增加CrM的吸收 6 ） ；（3）輔酶Q?10?[作為抗氧化劑 21 并繞過電子傳輸鏈（ETC） 19的配合 物I ]。我們?cè)谶@里報(bào)告了一項(xiàng)隨機(jī)，雙盲，安慰劑對(duì)照，交叉試驗(yàn)的結(jié)果，該試驗(yàn)研究了這種靶向聯(lián)合治療性雞尾酒聯(lián)合CrM，CoQ?10和α-硫辛酸對(duì)線粒體細(xì)胞病變患者的影響。

患者： 從麥克馬斯特大學(xué)的神經(jīng)肌肉和神經(jīng)代謝診所招募了17位具有明確或可能的線粒體疾病的患者。結(jié)合臨床癥狀，空腹血清乳酸濃度，肌肉活檢結(jié)果（紅色的纖維狀或細(xì)胞色素 c 氧化酶陰性纖維）和線粒體DNA（mtDNA）分析。僅8、9和13號(hào)患者未鑒定出DNA突變，對(duì)于線粒體神經(jīng)胃腸道腦病的患者，僅進(jìn)行確認(rèn)試驗(yàn)（胸苷升高，胸苷磷酸化酶活性降低）；然而，他們的乳酸濃度升高，組織學(xué)異常，運(yùn)動(dòng)耐力低下，有氧能力低，被認(rèn)為具有“可能的線粒體細(xì)胞病變”。一名患者由于個(gè)人原因未完成研究的一部分；因此，該患者的數(shù)據(jù)被排除在分析之外。最終分析基于16位患者（10位女性和6位男性），根據(jù)他們的診斷分為三組。表中顯示了患者人群的特征 1 。 第一組包括三位線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作的患者（MELAS組）。第二組包括三名被診斷為慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹（CPEO）的患者和一名被診斷為Kearns-Sayre綜合征（KSS）的患者，所有患者均在肌肉來源的mtDNA中被檢測(cè)出缺失（CPEO / KSS組）。第三組包括各種線粒體疾病的患者：六名線粒體細(xì)胞病變患者，兩名Leber遺傳性視神經(jīng)病變患者和一名線粒體神經(jīng)胃腸道腦病患者（其他組） 。該研究獲得了我們機(jī)構(gòu)倫理委員會(huì)的道德批準(zhǔn)，所有患者均提供了知情的書面同意。

CPEO，慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹；細(xì)胞病變，線粒體細(xì)胞病變；KSS，Kearns–Sayre綜合征；LHON，Leber的遺傳性視神經(jīng)病變；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作；MNGIE，線粒體神經(jīng)胃腸道腦?。o胸苷磷酸化酶活性，胸腺嘧啶核苷水平高）。

設(shè)計(jì)/干預(yù)。

患者參加了一項(xiàng)隨機(jī)，雙盲，安慰劑對(duì)照，交叉研究，其中每個(gè)參與者均接受了2個(gè)月的治療和安慰劑治療，兩次試驗(yàn)之間有5周的清除期。治療階段包括3 g CrM + 2 g葡萄糖+調(diào)味劑（新堿；加利福尼亞州帕洛阿爾托的Avicena），300 mgα-硫辛酸（Tishcon，Westbury，紐約）和120 mg CoQ?10（Qgel； Tishcon）每天的0：900和21:00。在安慰劑階段，將外觀相同，品嘗相同的粉末（5 g葡萄糖+調(diào)味劑； Avicena）和凝膠膠囊（大豆油； Tishcon）用作安慰劑。

禁食4小時(shí)后，兩個(gè)試驗(yàn)的患者在大約每天同一時(shí)間（2-3小時(shí)內(nèi)）在每個(gè)干預(yù)階段之前和之后完成測(cè)試。

測(cè)量。

僅在首次訪問時(shí)記錄參與者的身高和體重。所有其他訪視均采取了其他所有結(jié)果指標(biāo)。參與者使用定制的力傳感器設(shè)備進(jìn)行了握力，踝背屈（關(guān)節(jié)角度為90°）和膝蓋伸展強(qiáng)度測(cè)試，數(shù)據(jù)已直接輸入包含數(shù)據(jù)采集和分析軟件的計(jì)算機(jī)中，如前所述。 38 對(duì)于所有力量測(cè)量，參與者都在右側(cè)進(jìn)行測(cè)試，并根據(jù)手的大小進(jìn)行個(gè)性化設(shè)置，并在每次訪問之間保持恒定。為了達(dá)到峰值強(qiáng)度，參與者進(jìn)行了3個(gè)5s試驗(yàn)，相隔約30 s。記錄具有最佳結(jié)果的試驗(yàn)值。參與者還進(jìn)行了1分鐘的等距握力和踝背屈疲勞測(cè)試（9秒鐘工作時(shí)間：1秒鐘休息周期）。使用肺活量計(jì)（Koko； PDS Instrumentation，路易斯維爾，科羅拉多州）進(jìn)行肺功能測(cè)試，包括1秒內(nèi)的強(qiáng)制肺活量和強(qiáng)制呼氣量。每位患者每次訪視均至少完成兩次肺活量測(cè)定，以確保該值與他們的首次嘗試一致。進(jìn)行生物電阻抗（Prism BIA 101A； RJL Systems，Clinton Twp，密歇根州）以確定身體成分。

靜脈血液采樣和尿液采集。

從肘前靜脈將全血收集到預(yù)先冷卻的，裝有肝素（用于乳酸分析）或EDTA（用于測(cè)定CoQ?10）的真空管中，并以2500 rpm離心10分鐘。將血漿儲(chǔ)存在-80℃。每位患者都提供了尿液樣本樣品，將其約10 ml快速冷凍并保存在-80°C下用于肌酸，肌酐，8-羥基-2'-脫氧鳥苷（8-OHdG）和8-異前列腺素的后續(xù)分析（ 8-IsoP）。

乳酸

使用YSI 2300 Stat Plus乳酸分析儀（YSI，Yellow Springs，俄亥俄州）測(cè)定血漿乳酸濃度。乳酸的批內(nèi)和批內(nèi)變異系數(shù)分別為2.1％和1.7％。

輔酶Q?10。

使用電化學(xué)檢測(cè)器通過高效液相色譜（HPLC）測(cè)定血漿CoQ?10濃度。將血漿（0.5 ml）等分到裝有1 ml 1-丙醇和0.5 ml輔酶Q?9的10 ml真空容器中，混合5分鐘，然后在300? g下 離心5分鐘。使用0.22μM注射器過濾器過濾樣品，然后將其轉(zhuǎn)移到色譜瓶中，以進(jìn)行HPLC直接分析。將輔酶Q?9添加到混合物中以作為內(nèi)標(biāo)，作為輔酶Q?9的水平在人體血液中微不足道。將所得樣品注入裝有3μm填料的反相不銹鋼色譜柱（150×3 mm）RP‐C18中，該色譜柱帶有一個(gè)電化學(xué)檢測(cè)器（ESA，貝德福德，馬薩諸塞州），該檢測(cè)器連接到帶有單個(gè)電極的保衛(wèi)室（5020型） ； E = +350 mV）和帶有雙電極的庫侖分析池（5011型； E1 = -400 mV，E2 = +300 mV）。使用混合和脫氣的甲醇，1-丙醇和乙醇（70:20:10）的流動(dòng)相，其中含有50 mM乙酸鋰作為電導(dǎo)鹽，流速為0.5 ml / min，總運(yùn)行時(shí)間少于15分鐘?首先通過還原泛醌（E = -400 mV），然后氧化所得泛醇（E = +300 mV）測(cè)量輔酶Q?10。輔酶Q?10和輔酶Q?10?H?2在最后一個(gè)電極上以最高靈敏度檢測(cè)到。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.997。變異系數(shù)確定為2％。

肌酸和肌酐。

使用HPLC測(cè)定尿液中的肌酸濃度，肌酐和肌酸：肌酐的比例。將尿液（1 ml）等分到微量離心管中，并以10,000 rpm離心10分鐘。使用ddH?2?O?將尿液上清液稀釋至十分之一稀釋（0.1 ml上清液至0.9 ml ddH?2O）。使用冷藏自動(dòng)進(jìn)樣器將稀釋的尿液上清液保持在10°C。使用Hewlett Packard LC1100系列HPLC（Agilent，Mississauga，Ontario），將紫外檢測(cè)器設(shè)置為λ= 210 nm，將樣品注入250×4.6 mm C18 Phenomenex10-μHydro-RP 80色譜柱中。Hewlett Packard LC1100數(shù)據(jù)分析程序會(huì)生成校準(zhǔn)曲線并分析所得數(shù)據(jù)。流動(dòng)相是使用氫氧化鉀以1.0 ml / min的流速將磷酸二氫鉀（20 mM）調(diào)節(jié)至pH 5.0。變異系數(shù)為3.1％。

8-IsoP。

按照制造商的說明，使用商業(yè)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（MediCorp，蒙特利爾，魁北克）測(cè)定尿中的8-IsoP濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.988。變異系數(shù)為10.5％。8-IsoP值相對(duì)于肌酐（g）表示。

8-OHdG。

如前所述，使用HPLC測(cè)定尿液中8-OHdG的濃度。 3 ?8-OHdG值相對(duì)于肌酐（g）表示。

統(tǒng)計(jì)。

使用三向（組×處理×?xí)r間）或雙向（組×處理）重復(fù)測(cè)量方差分析（ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。鑒于先前的假設(shè)，即由于三種成分中的每一種都具有抗氧化特性，因此聯(lián)合療法可減少乳酸鹽并降低氧化應(yīng)激，我們對(duì)氧化應(yīng)激標(biāo)志物使用了單尾檢驗(yàn)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)重要結(jié)果時(shí)，將運(yùn)行Tukey HSD事后測(cè)試。所有分析均使用Statistica v。5軟件（StatSoft，Tulsa，俄克拉荷馬州）進(jìn)行。 P ?0.05的值被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)均以平均值±SD給出。

輔酶Q?10和肌酸：肌酸酐。

如預(yù)期的那樣，與安慰劑階段相比，聯(lián)合治療的血漿輔酶Q?10和尿肌酸：肌酐的比率明顯更高。聯(lián)合治療后（1.94±0.89μg/ ml）的血漿CoQ?10濃度比安慰劑（0.71±0.24μg/ ml）高172％（ P ?0.05;? n ?= 14），肌酸：肌酐比高600％ （2.45±2.08）比安慰劑（0.35±0.20）（ P 0.05）。

血漿乳酸鹽。

在血漿乳酸中發(fā)現(xiàn)顯著的治療×?xí)r間相互作用（ P ?0.05，單尾），在聯(lián)合治療階段血漿乳酸濃度較低，在安慰劑階段未觀察到效果（圖 1 ）。

*? P ?0.05，單尾。COMB，聯(lián)合療法；CPEO，慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹；KSS，Kearns–Sayre綜合征；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作。黑柱，聯(lián)合療法；開列，安慰劑。

觀察到FFM，TBW和％BF的顯著三向相互作用（組×治療×?xí)r間）（ P ?0.05）（圖 2 ），F(xiàn)FM和TBW升高，％BF降低僅對(duì)MELAS集團(tuán)。

（A） 三組中每個(gè)治療階段之前和之后的無脂質(zhì)量（FFM）， （B） 全身水（TBW）和 （C） 身體脂肪百分比（％BF）。*? P ?0.05；**? P ?0.05，單尾。COMB，聯(lián)合療法；CPEO，慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹；KSS，Kearns–Sayre綜合征；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作。黑柱，聯(lián)合療法；開列，安慰劑。

肺功能。

在1 s內(nèi)未觀察到治療，組或時(shí)間對(duì)強(qiáng)制肺活量或強(qiáng)制呼氣量的影響（表 2 ）。

表2.?肺功能（ n ?= 11）。

CPEO，慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹；FEV?1，用力呼氣量1 s；FVC，強(qiáng)制肺活量；KSS，Kearns–Sayre綜合征；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作。

強(qiáng)度措施。

盡管對(duì)于每個(gè)階段的結(jié)束，無論采用何種治療方法，峰值握力都降低的趨勢(shì)不明顯（ P ?= 0.054），但對(duì)于峰值握力的處理，組別或時(shí)間均無影響。對(duì)于握把或腳踝背屈疲勞（表示為峰值疲勞或區(qū)域疲勞）或峰值伸膝力量，也沒有任何治療，組或時(shí)間效應(yīng)。但是，觀察到踝背屈峰值強(qiáng)度存在顯著的雙向相互作用（治療×?xí)r間），安慰劑后，踝背屈峰值強(qiáng)度顯著下降（從31.16±13.68 Nm降至29.06±13.31 Nm），但未觀察到組合治療（從29.32±13.78 Nm到29.31±12.05 Nm）（ P 0.05， n ?= 16）。

尿液8-OHdG和8-IsoP。

尿8-OHdG沒有治療或組作用；然而，與安慰劑相比，聯(lián)合治療后降低8-OHdG /肌酐的趨勢(shì)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為3,472.05±1,883.06 ng / g肌酐與4,165±1,985.00 ng / g肌酐； P ?= 0.065）。觀察到8-IsoP的治療效果，因此與安慰劑相比較，聯(lián)合治療后觀察到較低的尿8-IsoP /肌酐含量（分別為6,572.47±3,356.64 ng / g肌酐與7,463.43±3,155.23 ng / g肌酐。 ； P ＜0.05）。

CrM，CoQ?10和硫辛酸 的聯(lián)合治療 可降低靜息乳酸濃度，防止峰值踝背屈強(qiáng)度降低和氧化應(yīng)激降低，這可通過尿中8-IsoP排泄和尿液的顯著減少來體現(xiàn)。 所有組中8-OHdG排泄的方向性趨勢(shì)。此外，在MELAS組中，患者的身體成分發(fā)生了積極變化（FFM和TBW增加，％BF降低）。聯(lián)合療法對(duì)肺功能，峰值握力或膝蓋伸展力量，或握力或腳踝背屈百分比或區(qū)域疲勞沒有影響。

從突變線粒體疾病的結(jié)果導(dǎo)致在氧化磷酸化的缺陷，導(dǎo)致在nonaerobic能源的依賴性增加 16 ， 38 和一個(gè)升高的血漿乳酸濃度。 16 ， 29 ， 38 無論是磷酸肌酸（PCR）系統(tǒng)，腺苷酸激酶/ AMP脫氨酶，或糖酵解/糖原分解可以被用來提供ATP;?但是，由于對(duì)糖酵解/糖酵解的依賴性增加，導(dǎo)致乳酸升高 38 CrM被包括在本研究中用于增強(qiáng)PCr系統(tǒng)的聯(lián)合治療中。聯(lián)合治療后尿肌酸：肌酐的升高和血漿乳酸濃度的降低間接表明聯(lián)合治療中的CrM成分可能為肌肉收縮提供了另一種厭氧能源。

從線粒體疾病患者的肌肉中觀察到總肌酸 36 和PCr? 14的 水平較低，進(jìn)一步支持了在此類患者中補(bǔ)充CrM的潛在益處。Kornblum等人的最新研究。 14 研究了補(bǔ)充CrM對(duì)CPEO或KSS患者肌內(nèi)PCr的影響。相反，先前在健康受試者中，觀察到的結(jié)果 6 ， 11 沒有導(dǎo)致CrM工作在補(bǔ)充盡管肌酸的血漿濃度顯著隨著由磷- 31核磁共振光譜法測(cè)量增加肌內(nèi)肌酸濃度。 14 當(dāng)前研究的局限性在于未在大腦或骨骼肌中測(cè)量肌酸或PCr含量。然而，伯克等。 6 表明，在健康志愿者中，將CrM與硫辛酸聯(lián)合使用時(shí)，肌肉PCr和總肌酸濃度顯著高于單獨(dú)補(bǔ)充CrM時(shí)。 因此，硫辛酸在我們的患者中可能會(huì)增加CrM的攝取，從而導(dǎo)致觀察到的靜息血漿乳酸濃度降低。

乳酸濃度較低的另一種或其他解釋可能是聯(lián)合治療改善了線粒體ATP的產(chǎn)生。輔酶Q?10是ETC中的電子受體，它將電子從絡(luò)合物I和II轉(zhuǎn)移到絡(luò)合物III。 16 ， 18 ， 33 的CoQ的目標(biāo)10的補(bǔ)充是旁路缺陷在ETC最大化ATP產(chǎn)生。 16 一項(xiàng)使用來自線粒體細(xì)胞病變患者的培養(yǎng)淋巴細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)合CoQ?10的聯(lián)合療法可增加線粒體ATP的產(chǎn)生，其中約49％歸因于CoQ?10。 19 相比之下，人類研究的結(jié)果不是決定性的，對(duì)于一些報(bào)道報(bào)道輔酶Q的有益效果10在降低血漿休息乳酸濃度患者的線粒體疾病， 1 ， 2 ，而另一些則沒有。 19 ， 20 ， 38 不同于以往的報(bào)道中，病人在我們的研究也給予硫辛酸。 硫辛酸天然存在于線粒體內(nèi)，是丙酮酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶的重要輔助因子。 33 硫辛酸用作有效的抗氧化劑 31 ， 33 ，并且降低氧化應(yīng)激在健康志愿者的標(biāo)記。 17 硫辛酸對(duì)ROS的清除作用增加，可能會(huì)減慢線粒體疾病中的“惡性循環(huán)”，在這種情況下，ROS的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致mtDNA突變，從而加劇氧化磷酸化的缺陷，從而導(dǎo)致更多的ROS產(chǎn)生 。 16 因此， 輔酶Q?10與硫辛酸結(jié)合使用，可能具有增加ATP產(chǎn)生的能力，從而導(dǎo)致替代能源的利用率下降，血漿血漿乳酸濃度降低。

安慰劑治療后，聯(lián)合療法減輕了峰值踝背屈強(qiáng)度的下降。據(jù)推測(cè)，在聯(lián)合治療CRM的成分會(huì)導(dǎo)致與安慰劑相比改進(jìn)的強(qiáng)度值，如CRM有被證實(shí)可以改善患者強(qiáng)度與線粒體疾病 35 ， 38 或杜氏肌營養(yǎng)不良癥， 34 和中老年健康志愿者。 5 鑒于我們沒有直接測(cè)量肌肉中的肌酸或PCr含量，因此我們不能得出結(jié)論說聯(lián)合療法中的CrM成分會(huì)導(dǎo)致踝背屈峰值強(qiáng)度下降。其他研究表明，使用CoQ可以改善線粒體疾病患者的強(qiáng)度10補(bǔ)充。 4 ， 9

先前的研究表明，補(bǔ)充CrM可以改善人體成分。 5 ， 34 的MELAS組在體本研究中證實(shí)的改善的組合物，增加FFM和TBW，和降低的％BF-以下組合療法;?但是，CPEO / KSS或其他組的患者未見這些改善。與本研究其他兩組中代表的其他形式的線粒體疾病患者相比，MELAS患者表現(xiàn)出更嚴(yán)重的臨床表型。因此，患有MELAS的患者在本研究中測(cè)量的所有變量（包括身體組成）方面都有更大的改善空間。

高水平的ROS和氧化應(yīng)激與線粒體疾病的病理生理有關(guān)。氧化應(yīng)激的更高水平已報(bào)告患者的線粒體疾病與對(duì)照組相比 21 ， 39 和患者的線粒體DNA突變更高程度的異質(zhì)性。 7 聯(lián)合療法中的所有三種化合物均具有降低氧化應(yīng)激的特性。 肌酸在無細(xì)胞系統(tǒng)中具有直接的抗氧化特性 15， 并為與多種氧化劑孵育的哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供細(xì)胞保護(hù)作用。 30 輔酶Q?10充當(dāng)脂質(zhì)的抗氧化劑和線粒體膜 10 ， 33 并且還可以通過繞過氧化磷酸化中的缺陷來減少ETC的電子泄漏。 10 最后， 補(bǔ)充硫辛酸后，健康志愿者的尿中異前列腺素水平較低 。 17 我們觀察到，與安慰劑相比，聯(lián)合治療后的8-IsoP濃度更低；但是，僅觀察到了8-OHdG含量降低的趨勢(shì)。異前列腺素是由花生四烯酸的過氧化作用形成的類似于前列腺素的化合物。 22 ?-? 24 它們是化學(xué)穩(wěn)定的，在體內(nèi)形成的，并且是一個(gè)過氧化特異性產(chǎn)物可檢測(cè)在穩(wěn)態(tài)水平在多種人類組織和體液中的 24 ;? 所有這些特征都使8-IsoP被認(rèn)為是評(píng)估體內(nèi)氧化應(yīng)激的最可靠標(biāo)記。 23 ， 24 的8-OHdG由鳥苷殘基的羥基化形成，并且經(jīng)常被用來作為對(duì)DNA損傷ROS的生物標(biāo)志物。 28 ， 39 由于的8-OHdG是用于向所有的DNA，不僅線粒體DNA的氧化損傷的生物標(biāo)記物，它是可能的核DNA的存在可能掩蓋或稀釋用于降低氧化性損傷的mtDNA的聯(lián)合治療的有益效果。

很少有隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)檢查了營養(yǎng)藥物在線粒體疾病患者中的作用。那些已經(jīng)進(jìn)行了嚴(yán)格的檢查，單一化合物的唯一的效果，如CRM的 12 ， 13 ， 38 或輔酶Q?10， 9 已審查。其他的研究，審查的聯(lián)合治療效果 1 ， 19 ， 20 ， 26 ， 27 ， 32 沒有使用與我們的研究相同的嚴(yán)格研究設(shè)計(jì)。結(jié)果，與這些研究進(jìn)行直接比較非常困難，特別是當(dāng)結(jié)合不同線粒體疾病人群中檢查了不同的化合物，組合和結(jié)果指標(biāo)這一事實(shí)時(shí)?？紤]到幾乎無限的組合，在將來進(jìn)行臨床試驗(yàn)評(píng)估之前，必須采用多種篩選方法，基于合理的首要原則測(cè)試潛在療法。方法論，例如使用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型或雜種動(dòng)物，可能被證明可用于評(píng)估“線粒體混合物”中目前使用的十幾種化合物的許多潛在組合。

我們的結(jié)果表明，與安慰劑相比， 針對(duì)線粒體功能障礙的三種后果的CrM，CoQ?10和硫辛酸的聯(lián)合療法可改善靜息血漿乳酸濃度，身體成分，踝背屈強(qiáng)度和氧化應(yīng)激。 但是，由于一個(gè)患者組比其他患者具有更大的獲益 （MELAS CPEO / KSS =其他） ，因此一種治療策略可能并不普遍適用于所有線粒體疾病。

這項(xiàng)研究由沃倫·拉默特（Warren Lammert）及其家人慷慨捐贈(zèng)。輔助酶Q?10和硫辛酸由Tishcon捐贈(zèng)，肌酸一水合物由Avicena捐贈(zèng)。

8-IsoP，8-異前列腺素;?8-OHdG，8-羥基-2'-脫氧鳥苷;?％BF，身體脂肪百分比；輔酶Q?10，輔酶Q?10?;?CPEO，慢性進(jìn)行性眼外肌麻痹；CrM，肌酸一水合物；ETC，電子傳輸鏈；FFM，無脂肪物質(zhì)；HPLC高效液相色譜；KSS，Kearns–Sayre綜合征；MELAS，線粒體腦病，乳酸性酸中毒和中風(fēng)樣發(fā)作；mtDNA，線粒體DNA；PCr，磷酸肌酸；ROS，活性氧；TBW，全身水

略

臺(tái)達(dá)的EHPLC只有一個(gè)9針端口,怎么實(shí)現(xiàn)與在線電腦及觸摸屏同時(shí)連接？

如圖所示，EH自帶兩個(gè)通信口，一個(gè)是上面的插子，是COM2，RS485，一個(gè)是下面的圓口，是COM1，RS232，（這個(gè)是8針，不是9針），因此完全可以實(shí)現(xiàn)與電腦和觸摸屏同時(shí)通信。

另外還可以添加F485，F(xiàn)232擴(kuò)展板，增加串口通信。

望采納。。。。。。

? ?廣州龍躍自動(dòng)化專業(yè)破解解密各類plc加密，全國24小時(shí)聯(lián)系手機(jī)：18520649527 【關(guān)技術(shù)】 微信：guanshiyou009如有任何問題請(qǐng)打手機(jī)或者添加微信，謝謝支持